Suas primeiras missões militares ocorreram na Espanha, nas frentes de batalha de Madri e do Norte, em outubro e novembro de 1936. Os dados oficiais divergem, mas conta-se que entre 293 e 422 desses caças soviéticos combateram nos céus da Espanha.
O I-16 foi considerado o top de linha dos caças até o surgimento do Messerschmitt Bf.109, em 1939. Quando a Segunda Guerra Mundial estourou, ele compunha a espinha dorsal da Força Aérea Soviética.
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